Las enzimas que participan en la vía glucolítica participan también en la gluconeogénesis; ambas rutas se diferencian por tres reacciones irreversibles que utilizan enzimas específicas de este proceso y que condicionan los dos rodeos metabólicos de esta vía.
Estas reacciones son:
De glucosa a glucosa-6-(P).
De fructosa-6-(P) a fructosa-1,6-bisfosfato.
De fosfoenolpiruvato a ácido pirúvico.

Conversión del piruvato en fosfoenolpiruvato [editar]
El oxaloacetato es intermediario en la producción del fosfoenolpiruvato en la gluconeogénesis. La conversión de piruvato a fosfoenolpiruvato en la gluconeogénesis se lleva a cabo en dos pasos. El primero de ellos es la reacción de piruvato y dióxido de carbono para dar oxaloacetato. Este paso requiere energía, la cual queda disponible por hidrólisis de ATP.
La enzima que cataliza esta reacción es la piruvato carboxilasa, una enzima alostérica que se encuentra en la mitocondria. La acetil-CoA es un efecto alostérico que activa la piruvato carboxilasa. Cuando hay niveles más altos de los necesarios de acetil-CoA para que se lleve a cabo el ciclo del ácido cítrico, el piruvato se dirige a la gluconeogénesis. El ion magnesio y la biotina son necesarios para una catálisis eficaz.
La biotina es portadora de dióxido de carbono y presenta un sitio especifico para que el CO2 se una de manera covalente. La biotina se enlaza covalentemente con la enzima y después el CO2 se incorpora al piruvato, formando así oxaloacetato.
La conversión de oxaloacetato a fosfoenolpiruvato es catalizada por la enzima fosfoenolpiruvato carboxinasa, la cual se encuentra en la mitocondria y el citosol. Esta reacción también incluye la hidrólisis de un nucleótido trifosfato, en este caso el GTP en vez del ATP.

Conversión de la fructosa-1,6-bisfosfato en fructosa-6-fosfato [editar]
La reacción de la fosfofructoquinasa de la glucólisis es esencialmente irreversible pero sólo debido a que está impulsada por la transferencia de fosfato del ATP. La reacción que tiene lugar en la gluconeogénesis para evitar este paso consiste en una simple reacción hidrolítica, catalizada por la fructosa-1,6-bisfosfatasa.
La enzima con múltiples subunidades requiere la presencia de Mg2+ para su actividad y constituye uno de los principales lugares de control que regulan la ruta global de la gluconeogénesis. La fructosa-6-fosfato formada en esta reacción experimenta posteriormente la isomerización a glucosa-6-fosfato por la acción de la fosfoglucoisomerasa.

Conversión de la glucosa-6-fosfato en glucosa [editar]
La glucosa-6-fosfato no puede convertirse en glucosa por la acción inversa de la hexoquinasa o la glucoquinasa; la trasferencia de fosfato desde el ATP hace a la reacción virtualmente irreversible. Otra enzima específica de la gluconeogénesis, la glucosa-6-fosfatasa, que requiere también de Mg2+, es la que entra en acción en su lugar. Esta reacción de derivación se produce también mediante una simple hidrólisis.
La glucosa-6-fosfatasa se encuentra fundamentalmente en el retículo endoplásmico del hígado con su lugar activo sobre el lado citosólico. La importancia de su localización en el hígado es que una función característica del hígado es sintetizar glucosa para exportarla a los tejidos a través de la circulación sanguínea.